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A OHB melhora a doença de Parkinson promovendo a biogênese mitocondrial através da via SIRT-1/PGC-1α



A doença de Parkinson (DP) é um distúrbio motor progressivo, neurodegenerativo, que afeta cerca de 1% da população com 60 anos ou mais. A DP é caracterizada pela degeneração de neurônios dopaminérgicos dentro da substância negra pars compacta (SNpc), levando a sintomas de bradicinesia, tremor de repouso e rigidez muscular. A doença também pode apresentar sintomas não motores, como disfunção do sono, comprometimento cognitivo e depressão. Embora uma variedade de possíveis mecanismos patogênicos tenham sido propostos ao longo dos anos, incluindo a liberação excessiva de radicais livres de oxigênio durante a quebra enzimática da dopamina, danos à função mitocondrial, perda de suporte nutricional e anormalidades na atividade da quinase, destruição da homeostase do cálcio e disfunção da degradação proteica, a patogênese detalhada ainda é incerta.


A oxigenoterapia hiperbárica (OHB) é um tratamento que coloca os pacientes em uma câmara hiperbárica acima de 1,4 atmosferas absolutas, permitindo que respirem oxigênio puro naturalmente. Comparado com a pressão normal, a OHB melhora esportes de tarefa única ou multitarefa e desempenho cognitivo em humanos saudáveis; no entanto, o mecanismo deste tratamento único ainda não é totalmente compreendido.


Pesquisas sobre os efeitos neuroprotetores da OHB mostraram que o oxigenoterapia hiperbárica pode inibir a inflamação, reduzir a hipóxia e melhorar a microcirculação do sistema nervoso. Houve relatos de casos de OHB sendo usado no tratamento de sintomas psiquiátricos em pacientes com DP. Além disso, foi demonstrado em um modelo de camundongo de Parkinson que a OHB pode efetivamente inibir a diminuição das células dopaminérgicas na substância negra. Embora esses resultados de pesquisa mostrem o potencial da OHB no tratamento da DP, o mecanismo neuroprotetor detalhado ainda não está claro.


Sabe-se que a DP está associada a defeitos na respiração mitocondrial. Essa hipótese surgiu no final da década de 1970, quando a exposição acidental a 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), um contaminante da síntese de 1-metil-4-fenil-4-propionoxi -piperidina (MPPP), foi encontrado para causar parkinsonismo e neurodegeneração DA. Também houve fortes evidências recentes que implicam a disfunção mitocondrial como uma via patogênica primária que leva à morte de neurônios dopaminérgicos na DP. O mecanismo subjacente pode ser a inibição do complexo I da cadeia de transporte de elétrons (ETC), que, por sua vez, aumenta as espécies reativas de oxigênio. A substância negra, em comparação com outras regiões do cérebro, é mais propensa à disfunção mitocondrial do complexo I, que resulta da geração de ROS nos neurônios dopaminérgicos da substância negra durante o metabolismo da DA.


Portanto, a função mitocondrial, particularmente sua preservação ou promoção, é de especial interesse como um potencial alvo terapêutico da DP e outros distúrbios neurodegenerativos. A biogênese mitocondrial é um processo pelo qual novas mitocôndrias são formadas pelo crescimento e divisão de mitocôndrias preexistentes. Envolve a síntese das membranas mitocondriais internas e externas e proteínas codificadas pelas mitocôndrias, síntese e importação de proteínas mitocondriais codificadas pelo núcleo e replicação do DNA mitocondrial (mtDNA). A biogênese mitocondrial é fortemente regulada por várias vias de sinalização celular. A sirtuína-1 (SIRT-1) e o receptor gamma ativado por proliferador de peroxissomo-1alfa (PGC-1α) é uma dessas vias principais e é considerado o regulador principal.


Por muito tempo, as estratégias de direcionamento mitocondrial têm sido estudadas por seu potencial no tratamento de lesões cerebrais e doenças neurodegenerativas, na esperança de fornecer neuroproteção, melhorando a função mitocondrial neuronal. Em diferentes modelos animais de lesão cerebral, a OHB melhorou a redox mitocondrial, aumentando a função mitocondrial em neurônios e células gliais para reduzir o estresse oxidativo, manter a integridade mitocondrial e inibir a via de apoptose relacionada às mitocôndrias para alcançar um efeito neuroprotetor.


Como a OHB não é invasiva e é eficaz e segura para o tratamento de muitas doenças, o objetivo deste estudo foi usar modelos in vitro e in vivo para investigar os mecanismos de proteção detalhados da OHB nos neurônios DA do SNpc, bem como avaliar seus efeitos terapêuticos sobre os sintomas motores em um modelo de camundongo de Parkinson.


Materiais e métodos


Animais e camundongos tratados com MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetra-hidropiridina (MPTP) e 1-metil-4-fenilpiridínio (MPP +)


Camundongos machos foram usados ​​neste estudo e aclimatados por 7 dias. Os animais foram mantidos a (22 ± 2°C) em ciclo claro/escuro de 12:12 horas e tiveram livre acesso a ração e água. Todos os procedimentos experimentais realizados foram aprovados pelo comitê de ética animal institucional. Dezoito camundongos machos foram divididos aleatoriamente em 3 grupos: grupo controle, grupo MPTP e grupo MPTP+HBOT (N=6 em cada grupo). Os camundongos do grupo MPTP e MPTP+HBOT receberam MPTP via intraperitoneal quatro vezes em intervalos de 2 h dentro de um dia. No dia seguinte ao tratamento com MPTP, os camundongos MPTP+OHB foram expostos a OHB a 2,5 ATA com oxigênio a 100% por 1 uma vez ao dia por 7 dias consecutivos. Ao final do esquema de tratamento, foram realizados testes comportamentais.


Teste de Atividade Locomotora


Os camundongos foram colocados no centro da câmara de teste de campo aberto (uma câmara branca de 50 × 50 × 25 cm com um topo aberto) e deixados para explorar livremente por 5 min.


Teste de força de preensão


A força de preensão dos membros anteriores e posteriores de camundongos C57BL/6 foi medida com um medidor de força de preensão. Os camundongos foram colocados no medidor de força de preensão e a cauda do camundongo foi puxada para trás a uma velocidade constante após agarrar a grade até sair da grade. O pico de força em gramas foi registrado quando os camundongos soltaram as patas da grade para cada medição. A análise foi realizada utilizando o pico de força médio de dez tentativas. Este teste foi realizado por uma pessoa para garantir a confiabilidade.


Avaliação de Desempenho Rotarod


O Rotarod foi usado para avaliar a coordenação motora. A avaliação depende do período de tempo que os camundongos podem se manter em uma haste rotativa. Antes do teste, cada animal foi submetido a um teste de 1 min na haste móvel. Eles foram colocados em uma haste giratória com faixas de aceleração de 3 a 30 rpm e avaliados quanto à coordenação motora por 300 s, e a latência para queda foi registrada. Camundongos normais podiam se manter na haste rotativa por um período indefinido de tempo. O desempenho motor foi avaliado 3 vezes ao dia com intervalos de 30 min e o tempo médio de retenção foi calculado de acordo com o protocolo previamente estudado.


Coloração de Imunofluorescência


Os neurônios foram fixados em paraformaldeído a 4%, incubados em Triton a 0,2% por 20 min para permeabilizar as células e, em seguida, bloqueados em BSA a 3% por 40 min em temperatura ambiente. Depois de serem lavadas com PBS, as células foram então incubadas com anticorpos primários de α-Tubulin a 4°C durante a noite, e os anticorpos ligados foram detectados com Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 595 anticorpo secundário IgG anti-coelho por 1 h em temperatura ambiente. Depois que as células foram lavadas três vezes com PBS, os núcleos das células foram então corados com DAPI por 10 min.


Resultados


A terapia com Oxigenoterapia Hiperbárica atenuou substância nigra perda neuronal dopaminérgica em camundongos tratados com MPTP


A DP é patologicamente caracterizada pela morte de neurônios dopaminérgicos no SNpc. Coramos os tecidos da substância negra usando um anticorpo específico contra tirosina hidroxilase (TH), que é um marcador para neurônios dopaminérgicos. A administração de MPTP resultou em uma perda drástica de neurônios dopaminérgicos, mostrando uma perda de 28% de neurônios TH-positivos na substância negra em comparação com o controle ( p < 0,01). A OHB mostrou um efeito protetor significativo nos neurônios dopaminérgicos contra a neurotoxicidade induzida por MPTP, preservando até 76% dos neurônios TH-positivos em comparação com o grupo MPTP ( p< 0,01). Isto foi ainda confirmado por análise de Western blot, que demonstrou um nível mais alto de proteína TH no SNpc lesionado de camundongos tratados com OHB em comparação com o dos camundongos MPTP. Portanto, a OHB atenuou a perda de neurônios dopaminérgicos induzida por MPTP em camundongos.


A oxigenoterapia hiperbárica melhora a atividade motora e a força de preensão em camundongos tratados com MPTP


Para explorar ainda mais o efeito da OHB nos sintomas motores de camundongos tratados com MPTP, o teste de atividade locomotora, teste de força de preensão e teste de rotarod foram administrados. Após um tratamento de 7 dias com OHB, a distância total movida e a velocidade média dos camundongos de tratamento MPTP+HBOT foram significativamente aumentadas em relação ao grupo MPTP. Além disso, o tratamento com OHB aumentou a força de preensão da extremidade em camundongos de tratamento MPTP+OHB para camundongos MPTP não tratados. O tratamento dos camundongos MPTP com OHB aumentou significativamente o tempo necessário para cair em relação aos camundongos MPTP não tratados. Esses resultados indicam que a OHB melhora a capacidade de atividade e resistência muscular de camundongos com DP e melhora a coordenação do movimento, alcançando a possível reversão da discinesia parkinsoniana induzida por MPTP.


A oxigenoterapia hiperbárica inibe a neuroinflamação no cérebro de camundongos tratados com MPTP


Os camundongos tratados com MPTP mostraram expressão significativamente aumentada de NF-κB p65, COX-2, iNOS e TNF-α no tecido cerebral quando comparados ao grupo controle. Em contraste, camundongos tratados com OHB em camundongos tratados com MPTP demonstraram níveis drasticamente reduzidos de expressão de NF-κB p65, COX-2, iNOS e TNF-α em comparação com camundongos tratados apenas com MPTP.


A oxigenoterapia hiperbárica atenua a apoptose do tecido do mesencéfalo em camundongos tratados com MPTP


A OHB poderia reduzir esses fenômenos e diminuir a razão Bax/Bcl-2. Estes resultados indicam que a OHB atenua a apoptose dos tecidos do mesencéfalo em camundongos tratados com MPTP.


A terapia com OHB ativa o fator neurotrófico em camundongos tratados com MPTP e promove o crescimento de neuritos de células SH-SY5Y tratadas com MPP +


Os camundongos tratados com MPTP apresentaram expressão significativamente reduzida de pCREB/CREB e BDNF no tecido cerebral quando comparados ao grupo controle. O tratamento com OHB aumentou significativamente a expressão de pCREB/CREB e BDNF quando comparado com os camundongos MPTP. O comprimento dos neuritos das células SH-SY5Y foi reduzido por MPP + ( p < 0,001), enquanto o tratamento com OHB atenuou a retração dos neuritos ( p< 0,001). Esses resultados indicam que a OHB promove o crescimento de neuritos ativando a via pCREB/BDNF.


Discussão


No presente estudo, os efeitos do tratamento com OHB foram examinados nas atividades locomotoras e neurônios dopaminérgicos na substância negra de camundongos tratados com MPTP. De acordo com nossos resultados, as atividades locomotoras, quantificadas pela distância total percorrida, força de preensão e tempo no rotarod, foram melhoradas nos camundongos MPTP+OHB.


Estudos anteriores sugeriram que a exposição às sessões com o OHB aumenta a capacidade oxidativa das fibras musculares esqueléticas e dos motoneurônios espinhais que as inervam e, portanto, tem implicações para a atividade locomotora. Nossos resultados parecem estar de acordo com esses achados anteriores. Por outro lado, a degeneração seletiva de neurônios dopaminérgicos e a redução da expressão de HT no SNpc, juntamente com a diminuição dos níveis de transportador de DA (DAT) e DA no estriado, são as principais características patológicas da DP e se correlacionam com a disfunção motora. O estudo observou que a OHB atenuou a diminuição das células dopaminérgicas e a redução da expressão de TH no mesencéfalo de camundongos tratados com MPTP. Portanto, a OHB parece ser um tratamento promissor para a DP, com potencial clínico excitante.


Além disso, também há relatos de casos do uso de OHB no tratamento de sintomas psiquiátricos em pacientes com DP. Embora nossos experimentos não tenham examinado os efeitos emocionais da OHB no modelo animal da doença de Parkinson, a possível interferência do comprometimento motor e da expressão locomotora nos transtornos de humor estão relacionados à DP (ansiedade, depressão), o que demonstrou claramente seu impacto no desempenho motor em o teste OF. Portanto, não pode descartar a possibilidade de que a OHB possa melhorar os resultados dos comportamentos locomotores melhorando os sintomas psiquiátricos do modelo animal, e isso requer mais experimentos para provar.


Embora a OHB tenha um efeito na preservação de células dopaminérgicas e função motora em camundongos tratados com MPTP, o mecanismo exato ainda não está claro. A neuroinflamação é conhecida por ser um dos processos mais importantes envolvidos na patogênese da DP. MPTP é uma potente neurotoxina usada para imitar a DP em uma ampla gama de organismos, incluindo primatas não humanos, cobaias, camundongos, cães e gatos. No estudo, foi demonstrado que a OHB protege contra a neuroinflamação induzida por MPTP na DP, inibindo a via de sinalização NF-κB no mesencéfalo de camundongos tratados com MPTP, indicando que a OHB tem o efeito de suprimir a neuroinflamação.


Além disso, o efeito antiapoptótico da OHB foi demonstrado mediando o aumento da expressão de Bcl-2 e aumentando a biodisponibilidade de oxigênio intracelular. Ambos podem contribuir para a preservação da integridade mitocondrial e reduzir a ativação da via mitocondrial de apoptose. Ao mesmo tempo, a OHB também atenua a diminuição da razão Bcl-2/Bax e reduz a expressão de citocromo ce o aumento do nível de caspase 3 clivada no mesencéfalo de camundongos tratados com MPTP. Esses resultados indicam que a OHB tem o efeito antiapoptótico para combater a apoptose dos neurônios DA na DP.


Conclusões


Atualmente, a causa da DP em humanos permanece incerta e, apesar do progresso contínuo nas pesquisas, a maioria das opções de tratamento são sintomáticas e não curativas. No presente estudo, o estudo forneceu evidências preliminares de que o tratamento com OHB pode diminuir a neuroinflamação ao inibir a via de sinalização NF-kB e promover a neurogênese através da ativação da via CREB/BDNF. Além disso, a OHB pode melhorar a biogênese mitocondrial através da cascata de sinalização dependente de SIRT-1/PGC-1α e ter a capacidade de melhorar as funções dopaminérgicas aumentando a expressão da tirosina hidroxilase. Assim, nossos resultados sugerem que a OHB tem potencial como tratamento adjuvante, protegendo os neurônios dopaminérgicos no tratamento clínico da DP.


Artigo original aqui.




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