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Estudo experimental em ratos sobre os efeitos da OHB nas lesões teciduais da pancreatite aguda

Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e Hospital de Clínicas de Porto Alegre estudam os efeitos da Oxigenoterapia Hiperbárica nas lesões teciduais em modelo experimental de pancreatite aguda induzida por ligadura do ducto pancreático com 48 ratas Wistar adultas que foram randomizadas em dois grupos (n = 24): grupo controle e grupo de Oxigenoterapia Hiperbárica.


O segundo grupo foi tratado com uma sessão diária de duas horas de oxigenoterapia hiperbárica a 2,5 ATA iniciada 6 horas após a ligadura do ducto pancreático. Os dois grupos foram divididos em 3 subgrupos de 8 ratos cada um submetido à eutanásia nos dias 1, 3 e 7 após a indução de pancreatite aguda.


Medidas de saída principais: O pâncreas foi avaliado de acordo com os seguintes critérios histopatológicos: edema, hemorragia, necrose acinar e infiltração leucocitária.

Resultados: A Oxigenoterapia Hiperbárica foi eficiente em reduzir significativamente a necrose acinar no primeiro dia (P = 0,049) e os focos de hemorragia no sétimo dia (P = 0,050). O edema e a infiltração leucocitária não mostraram a redução esperada.


Introdução


A pancreatite aguda é uma doença inflamatória que afeta o pâncreas e os tecidos peripancreáticos, podendo evoluir para falência de múltiplos órgãos. Os primeiros eventos intracelulares são observados com a ativação do tripsinogênio em tripsina dentro dos grânulos do zimogênio que é seguido pela cascata de ativação de outras enzimas, proteases, citocinas, radicais livres de oxigênio e moléculas vasoativas.


A ligadura do ducto pancreático no duodeno é uma abordagem experimental que promove a progressão da pancreatite aguda de forma semelhante à observada na pancreatite aguda biliar em humanos. No entanto, a ligadura do ducto pancreático não é classificada como uma condição grave, pois permite a sobrevivência do animal por mais de 14 dias e apresenta mortalidade quase nula.


A Oxigenoterapia Hiperbárica (OHB) é uma técnica que oferece às células estressadas o que elas mais precisam: oxigênio (O2). Isso só é possível porque a ingestão de O2 em valores de pressão atmosférica acima de 1 atmosfera absoluta (ATA), além de saturar os eritrócitos a 100%, também promove a diluição do gás no plasma. Em conjunto, a OHB leva à hiperóxia tecidual e circulatória com uma série de efeitos:


1- diminuição do edema em consequência do efeito vasoconstritor e eliminação da hipóxia tecidual que surge em decorrência do edema e da isquemia;

2- prevenção e ação contra infecções, ao oferecer os níveis de O2 de que os leucócitos precisam para desempenhar seu papel oxidativo, além de gerar uma condição inóspita ao crescimento de microrganismos;

3- a promoção da angiogênese, para aumentar os depósitos de colágeno e para produzir o fator de crescimento do endotélio vascular por fibroblastos ativados;

4- aumento da produção de substâncias antioxidantes;

5- uma diminuição na aderência de leucócitos ao endotélio vascular que melhora a microcirculação. OHB foi testado em diversos modelos experimentais de pancreatite aguda revelando um aumento na produção de antioxidantes e uma diminuição nos parâmetros de estresse oxidativo e nos escores histopatológicos.


O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos do tratamento da OHB na pancreatite aguda induzida por ligadura.


Métodos


Quarenta e oito ratas Wistar adultas (Rattus norvegicus albinus) pesando entre 200 e 280 g foram utilizadas como modelo animal neste estudo. Todos os animais foram mantidos em caixas de polipropileno cobertas por grades de tela de metal. As caixas eram forradas com serragem esterilizada em autoclave, que era substituída três vezes por semana. Os ratos receberam ração. água, e foram mantidos em ritmo circadiano de 12 h em ambiente controlado durante todo o experimento, conforme estabelecido pelo Guia de Cuidados e Utilização de Laboratório Animais.


Os ratos foram randomizados para formar dois grupos de 24 ratos cada: um grupo de controle e um grupo de tratamento OHB. Esses grupos foram então divididos em 3 subgrupos com 8 ratos cada (eutanásia após 1, 3 e 7 dias da indução da pancreatite aguda).


Indução de pancreatite aguda


Todos os animais foram submetidos a jejum de 12 horas e, a seguir, foram anestesiados por sedação com halotano em uma campânula, à qual foi aplicada uma injeção intradérmica de 0,1 mL de cloridrato de tiletamina 125 mg e cloridrato de zolepan 125 mg com 0,05 mL de morfina para analgesia. O procedimento cirúrgico foi iniciado com uma laparotomia mediana de 2-3 cm. Em seguida, a alça duodenal foi reconhecida e elevada para permitir a visualização do ducto biliopancreático. A junção do ducto biliopancreático e do duodeno foi identificada e caracterizada por meio de um fio monofilamento de polipropileno 5-0. Outra ligadura foi realizada neste ducto, em um ponto anterior ao ducto pancreático e entre 1,0 e 1,5 cm abaixo do hilo hepático.


Oxigenoterapia Hiperbárica (OHB)


Os animais do grupo OHB foram acomodados em caixas de polipropileno 15x15x20 cm revestidas com grades de tela de metal. As caixas foram projetadas para caber na câmara hiperbárica. A pressurização foi realizada a 100% O2 ao atingir 2,5 ATA, momento após o qual as caixas foram mantidas na câmara por 120 min, procedimento a seguir denominado sessão de OHB. Essas sessões de oxigenoterapia foram repetidas uma vez ao dia, até o intervalo de tempo definido para a necropsia. O subgrupo do primeiro dia foi o único grupo a receber duas sessões de OHB em 24 h: a primeira sessão 6 h após a indução da pancreatite aguda e a segunda sessão de OHB na manhã seguinte, antes da eutanásia.


Inspeção Macroscópica


No 1º, 3º e 7º dias de pós-operatório, os 8 ratos de cada grupo foram novamente anestesiados e eutanasiados por intoxicação com halotano. As cavidades abdominal e torácica foram abertas e submetidas a um exame abrangente, com todas as lesões visualizadas macroscopicamente sendo fotografadas. Os diâmetros do ducto pancreático dilatado foram medidos.


Análise Histopatológica


O pâncreas, duodeno e parte do estômago foram fixados em formol tamponado a 10%. O pâncreas foi então dissecado e seccionado ao longo de seu eixo longitudinal e posteriormente dividido em três seções transversais como cabeça, corpo e cauda. Este material foi tratado de acordo com técnicas analíticas padrão e corado com hematoxilineosina para produzir lâminas para exame microscópico por um patologista cego para os grupos de estudo. Para cada animal foram preparadas duas lâminas, com a seleção aleatória de quatro campos em cada seção transversal para fins de pontuação. Lesões histopatológicas foram analisadas de acordo com os seguintes critérios:


a) Edema: derramamento de fluido seroso entre as zonas acinares, especialmente os septos;

b) Hemorragia: presença de eritrócitos fora do leito vascular;

c) Necrose acinar: presença de alterações citoplasmáticas na microvascularização. Câmara hipertecido para pequenos animais. com degeneração do núcleo da célula espalhada;

d) Infiltração leucocitária: presença de células polimorfonucleares e mononucleares em zonas edematosas.


Resultados:


Amilase


O diagnóstico laboratorial de pancreatite aguda foi confirmado em apenas seis animais de cada grupo no 1º dia. Os níveis de amilase não foram testados nos ratos sacrificados após 3 e 7 dias, porque os níveis de amilase caem nos dias após a indução da pancreatite. Os níveis médios de amilase em ratos sacrificados no primeiro dia após a ligadura do ducto pancreático foram 3.517 ± 1.754 U / L (variação: 2.000-5.850 U / L) no grupo de controle e 5.428 ± 3.773 U / L (variação: 2.000-10.230 U / L) no grupo de terapia OHB(P = 0,415). Todos os animais apresentaram níveis de amilase pelo menos duas vezes maiores que o limite superior do intervalo de referência e os critérios para diagnóstico de pancreatite foram histológicos.


Inspeção Macroscópica


A inspeção macroscópica da cavidade abdominal revelou a presença de processo inflamatório no pâncreas, e focos de esteatonecrose (necrose gordurosa) espalhados na cavidade, mais proeminentes no grupo sacrificado no 3º dia e quase indetectável nos espécimes do 7º dia, com exceção de um rato do grupo controle sacrificado no 3º dia que apresentou grande quantidade de necrose gordurosa, além de sinais de estresse e distensão das alças intestinais, como é tipicamente observado em processos de isquemia intestinal. Os ratos sacrificados no 7º dia exibiram intensa dilatação dos ductos biliar e pancreático observada macroscopicamente. Em 4 ratos do grupo controle, o diâmetro médio do ducto pancreático foi de 5,25 ± 0,29 cm, enquanto, para os 7 ratos do grupo OHB, esse valor desceu para 4,21 ± 1,60 cm (P = 0,255). O diâmetro médio do ducto biliar foi de 6,88 ± 0,85 cm e 7,71 ± 2,94 cm nos grupos controle e OHB, respectivamente (P = 0,849). A resposta inflamatória no pâncreas foi mínima e a necrose de gordura na cavidade abdominal foi escassa.


Investigação Microscópica


Um animal do grupo OHB sacrificado no 7º dia foi acidentalmente perdido. Ao comparar os resultados dos escores histológicos do grupo controle e do grupo OHB, observou-se diferença estatisticamente significativa na redução da necrose acinar no pâncreas para este último (P = 0,049), apenas nas primeiras 24 horas. O uso de uma sessão de OHB uma vez ao dia por 7 dias foi eficiente na diminuição do número de sítios hemorrágicos (P = 0,050). A comparação da ocorrência de edema e inflamação do pâncreas entre os animais dos grupos OHB e controle não apresentou diferenças estatisticamente significativas.


Discussão


Em consequência das diversas manifestações de pancreatite aguda, torna-se difícil uma representação abrangente e realista de sua progressão em humanos. Não existe tal modelo experimental considerado ideal para descrever a pancreatite aguda, e a abordagem experimental adotada depende dos objetivos principais dos trabalhos de pesquisa individuais. Ainda, o modelo de ligadura do ducto pancreático é de fácil execução e reprodução, possibilitando o estudo de lesões histológicas como edema, necrose, hemorragia e infiltração leucocitária. Além disso, o método mimetiza a pancreatite aguda biliar e impõe taxas mínimas de mortalidade à amostra, uma vez que a pancreatite aguda grave não se desenvolve.


O conjunto de pesquisas publicadas sobre o papel da OHB na pancreatite aguda é muito limitado, tanto do ponto de vista clínico quanto experimental. Bases de dados não indexavam a publicação de estudos sobre OHB em modelo de ligadura de ducto pancreático, pelo menos até abril de 2008.


Em 1998, houve estudo sobre os efeitos da OHB nas alterações microcirculatórias (a técnica usada foi a técnica de microscopia vital de vênulas pós-capilares), lesões de tecido e níveis de malondialdeído (um radical livre de oxigênio) produzidos durante as primeiras 12 horas após a indução de pancreatite aguda por ceruleína iv e ácido glico-oxicólico intraductal. Os resultados mostraram que a OHB melhora o fluxo de eritrócitos e reduz a adesão dos leucócitos ao endotélio venular. Além disso, o tratamento melhorou o estado de gravidade das alterações histológicas relacionadas ao edema, bem como inflamação, hemorragia e necrose, e também levou a níveis mais baixos de malondialdeído em comparação com o grupo de controle.


Outra pesquisa foi feita referente a pancreatite induzida por taurocolato de sódio 4% e tratamento OHB (2,5 ATA por 90 min, a cada 12 h, com até 8 sessões), e mostraram uma diminuição na gravidade da lesão tecidual, um declínio na incidência de necrose (de 54 para 40%, P = 0,02), e um aumento na sobrevida após 7 dias (de 27 para 40%). No presente estudo, os animais que receberam duas sessões de OHB e foram sacrificados 24 horas após a indução da pancreatite aguda apresentaram menor incidência de edema, inflamação, hemorragia e necrose (apenas os números de necrose foram estatisticamente significativos; P = 0,049). Esses achados podem ser explicados pelas obstruções observadas na microcirculação do pâncreas e de outros órgãos em decorrência da adesão dos leucócitos ao endotélio vascular, que podem, em última instância, aumentar a incidência de necrose, inflamação e edema tecidual. Além disso, os leucócitos ativados são os principais agentes responsáveis ​​pela produção de radicais livres de oxigênio, desenvolvendo estresse oxidativo que por sua vez está por trás da resposta inflamatória sistêmica e da falência de múltiplos órgãos.


Em um estudo de OHB como tratamento para pancreatite aguda necrosante grave em pancreatite aguda induzida por taurocolato de sódio 3% em ratos, usou duas sessões diárias durante cinco dias. Os níveis de malondialdeído, superóxido dismutase (SOD) e atividades da glutationa peroxidase foram os parâmetros medidos nos eritrócitos e no tecido pancreático. A OHB produziu resultados significativos na redução dos níveis de oxidação em comparação ao grupo controle, devido à diminuição dos níveis de malondialdeído e ao aumento da atividade antioxidante por meio do aumento das atividades da SOD e da glutationa peroxidase, tanto no tecido pancreático quanto nos eritrócitos. Números mais baixos de mortalidade também foram observados no grupo OHB em comparação com o grupo controle. Resultados semelhantes foram encontrados em um estudo desses antioxidantes no parênquima pulmonar.


O efeito da OHB foi estudado em um modelo de pancreatite aguda necrotizante que utilizou porcos como modelo animal, e observaram que todos os animais (n = 4) no grupo que não foi tratado eventualmente morreram enquanto, no grupo tratado, dois de 3 animais sobreviveu. Esses animais apresentaram zonas necróticas mais claramente definidas, e a conclusão foi que a OHB reduz a mortalidade e melhora o prognóstico na pancreatite aguda necrotizante.


No presente estudo, como o desenho experimental não incluiu pancreatite aguda necrosante grave e a mortalidade foi um desfecho indesejado, uma sessão de OHB uma vez ao dia foi adotada para estabelecer os efeitos da OHB nas lesões teciduais ao longo dos sete dias de tratamento. Esse aspecto de nosso protocolo experimental é explicado pelo fato de que uma única sessão de OHB por dia é a abordagem normalmente adotada no tratamento de doenças humanas inflamatórias e traumáticas. Até onde sabemos, não existem estudos que demonstrem o período em que se manifestam os efeitos da hiperóxia nos tecidos pancreáticos. Da mesma forma, nenhum conhecimento da pressão ideal de ATA é indicado para o tratamento de tais casos. Isso explica porque não foram obtidos resultados estatisticamente significativos para o grupo de ratos sacrificados no 3º dia. Na verdade, tal resultado foi uma surpresa e prova a necessidade de protocolos de pesquisa para estudar os regimes de OHB ideais a serem observados na pancreatite aguda induzida por ligadura de ducto pancreático. Ao longo dos sete dias de tratamento, a OHB mostrou ser capaz de reduzir todos os parâmetros histológicos medidos. No entanto, entre os parâmetros investigados, apenas a redução dos locais de hemorragia foi estatisticamente significativa, possivelmente devido aos benefícios da OHB para a microcirculação. Pode-se hipotetizar que a ausência de significância estatística nos demais parâmetros pode ser consequência da perda acidental de um animal do grupo OHB do 7º dia. De fato, consideramos as implicações de adicionar um novo animal ao grupo para compensar essa perda. Porém, essa ideia foi rejeitada, pois um teste estatístico revelou que nenhuma diferença significativa seria observada entre os grupos, mesmo que o animal perdido fosse considerado como apresentando o maior escore de necrose.


Conclusão


A adoção de uma sessão de OHB uma vez ao dia a 2,5 ATA reduz de forma eficiente a hemorragia e a necrose acinar, embora não seja suficiente para reduzir o edema e a infiltração leucocitária.


O estudo completo está disponível aqui

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