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Estudo do efeito da OHB na viabilidade de retalhos cutâneos dorsais em ratos

Sabe-se até o momento, que a Oxigenoterapia Hiperbária (OHB) entre as opções terapêuticas para aumentar a cicatrização de ferida em retalhos expostos à hipóxia, tem mostrado bons resultados no modelo de rato. A OHB aumenta a densidade microvascular e pode ajudar a regenerar tecidos mal vascularizados, como anastomose colorretal e rins expostos a lesão de isquemia / reperfusão.


No entanto, existem poucas evidências sobre os efeitos de OHB em retalhos após exposição ao tabaco. Por esse motivo, esse estudo teve como objetivo analisar os efeitos do oxigênio hiperbárico terapêutico sobre a viabilidade de retalhos cutâneos em ratos expostos ao tabaco.


Introdução


Fumar é um problema de saúde global. De acordo com relatório da Organização Mundial da Saúde (OMS), o consumo de tabaco se tornou uma epidemia e o tabagismo é responsável por 5,4 milhões de mortes anualmente, tornando-a a causa mais importante de mortes evitáveis.


O mesmo relatório afirma que, no Brasil, a prevalência de tabagismo entre adultos com mais de 18 anos é 16,2%. Nos EUA, em 2005, a prevalência nacional de tabagismo foi de 20,9%.


Hábitos de fumar aumentam o risco de ferida no pós-operatório complicações de cicatrização, como deiscência, necrose, atraso na cicatrização e infecção.

Os componentes do cigarro podem causar desequilíbrio inflamatório e consequentemente diminuir a cicatrização de feridas, redução na quimiotaxia, desequilíbrio na enzima proteolítica atividade e seus inibidores e redução de fibroblastos migração.


Material e métodos


Vinte ratos Wistar de 8 semanas de idade, com peso variando de 200 a 250 g, foram mantidos em uma instalação de animais, a temperatura de 24 ° C, o ciclo dia / noite durou 12 horas e havia comida e água disponíveis. O estudo em animal foi aprovado pelo comitê de ética da FMUSP. Este modelo animal é aceito para imitar um paciente com um hábito de fumar moderado.


Os animais foram divididos em dois grupos: um grupo controle em quais eles foram expostos ao ar ambiente (n = 10) e um grupo de oxigenoterapia hiperbárica (OHB) em que os animais receberam 100% de oxigênio em 2,0 atmosferas absoluto (ATA) (n = 10).


Exposição de tabaco


O estudo foi baseado no modelo descrito por Biselli, onde ratos foram submetidos à inalação de fumaça de tabaco. Eles foram mantidos na caixa de exposição por 30 minutos, duas vezes por dia. Dois furos em cada parede lateral da caixa serviram como entrada para uma mistura de tabaco fumaça e ar sintético em um buraco e para a ingestão de ar sintético somente no outro.


As posições dos animais eram giradas a cada exposição a garantir que todos os animais experimentassem as mesmas concentrações de fumaça de tabaco durante o experimento.


O fluxo de ar sintético foi controlado por um medidor conectado a um cilindro de ar sintético e mantido a 1,5–2 L / min. A segunda entrada de ar sintético e fumaça de tabaco, aspirada por uma peça em Venturi conectada para um cigarro aceso. O fluxo laminar de ar sintético, passando através de uma seção de menor diâmetro, é acelerada, causando uma diminuição da pressão do ar neste ponto (efeito Venturi), permitindo aspirar a fumaça do tabaco.


A diminuição da pressão no ponto de redução do diâmetro no tubo depende do fluxo de ar sustentado. Portanto, por controlar a entrada de ar sintético na segunda entrada, a quantidade de fumaça de cigarro aspirada ao sistema e direcionado para dentro da caixa será igualmente controlado. Este permite o controle da concentração de monóxido de carbono (CO) dentro da caixa, medido por um sensor de CO (Toxi / Oxy Pro,Biosystems, Connecticut, EUA) a 300-350 ppm (partes por milhão).

A entrada de ar sintético na segunda entrada foi realizada estável a aproximadamente 1,5 L / min devido a variações no CO concentrações entre 300 e 350 pm. Os cigarros utilizados foram a marca Derby (Souza Cruz), com 0,8 mg nicotina, 10 mg de alcatrão e 10 mg de monóxido de carbono por cigarro.


A cada exposição, aproximadamente 10 a 12 cigarros eram consumidos por 30 min. Os ratos foram expostos ao tabaco por dois meses e após 60 dias de exposição foi realizado o procedimento cirúrgico.


Depois, os animais foram expostos ao tabaco por mais sete dias e então sacrificados. Durante esse período de sete dias, os animais foram submetidos ao protocolo OHB ou mantidos em ar ambiente (grupo controle).


Procedimento cirúrgico


Sob anestesia inalatória (isoflurano 200 mL / min para induzir 100 mL / min para manter a anestesia), os ratos foram posicionados em decúbito dorsal com tiras de borracha presas acima das articulações superfície de madeira projetada especificamente para esta finalidade.


A antissepsia foi realizada com clorexidina a 0,5%. A incisão foi feita com lâmina de bisturi, na pele e panniculus carnosus, para formar um retalho de 10 x 3 cm do nível caudal. Esse retalho foi incisado na fáscia profunda sobre musculatura dorsal do rato. A partir da caudal dorsal extremidade, as estruturas do panniculus carnosus foram corte até o nível da escápula.


Após elevar e reposicionar o retalho, este foi suturado com 4–0 pontos de nylon monofilamento em intervalos de 1 cm.


Este modelo (3 x10 cm) exibe necrose em 40% da área total do retalho experimental. Após exposição a fumaça de tabaco, foi observado um aumento na necrose para 74%.


Viabilidade do retalho cutâneo dorsal macroscópico


Análise


No sétimo dia de pós-operatório, imediatamente após eutanásia, os animais foram posicionados em decúbito dorsal. As abas foram fotografadas (Olympus Stylus focus 3,5–5 mm, Tokio, Japão) com uma régua em centímetros ao longo o comprimento do retalho. As imagens foram digitalizadas e transferido para um computador.

Foram realizadas análises histopalógica, microscópica, de biomarcadores, extração de RNA, síntese de Cdna e análise estatística.


Cálculo do tamanho da amostra


De acordo com o estudo, a área necrótica no grupo controle foi 43,84 ± 4,04 e o do grupo OHB, 38,30 ± 3,27. Considerando um valor alfa de p de 0,05 e 80% de potência, a amostra foi determinada em 10 animais por grupo.


Resultados


Dois animais foram perdidos, um de cada grupo, por autofagia do retalho o que inviabilizou sua análise.


Na análise macroscópica - O grupo OHB mostrou um aumento na área viável em relação ao grupo controle (84% versus 47%, p = 0,009, respectivamente).


Análise microscópica - Este estudo mostrou diferenças entre o grupo controle e grupo OHB em apêndices dérmicos (1,69 ± 0,54 versus 1,87 ± 0,58, p = 0,04, respectivamente) e angiogênese (1,29 ± 0,45 versus 1,82 ± 0,64, p \ 0,001, respectivamente).


Análise iNOS e VEGF-a - houve também uma diferença significativa na expressão do gene iNOS entre o grupo controle e grupo OHB (0,926 ± 1,4 versus 0,04 ± 0,1 p = 0,002, respectivamente).


No entanto, não houve diferença na expressão do gene VEGF-a detectado entre o grupo controle e o grupo OHB.


Exposição à OHB


Todos os animais deste grupo foram submetidos a doses diárias de 100% de oxigênio em sessões de 2 horas a 2,0 ATA por sete dias seguidos. Esta decisão foi baseada em um estudo de Weber. Os autores compararam dois regimes diferentes de OHB: uma vez ao dia (2 ATA por 90 min) versus duas vezes ao dia (2 ATA por 90 min). Os resultados foram semelhantes ao diminuir a necrose do retalho com ambos os regimes de oxigênio hiperbárico.


No presente estudo, todos os animais expostos ao tabaco no grupo de oxigênio hiperbárico submetido a cortes cutâneos dorsais, a cirurgia mostrou maior viabilidade do retalho em comparação com os no grupo oxigênio não-hiperbárico (controle) (p = 0,009).


Vale ressaltar que esses animais continuaram com a exposição ao tabaco durante a OHB. Portanto, a OHB melhorou a viabilidade dorsal cutânea no pior cenário clínico (pacientes que não pararam de fumar).



Na literatura, Otto et al. mostrou a eficácia de OHB na viabilidade de retalhos cirúrgicos em 469 diabéticos pacientes com hábito de fumar pesado (definido como consumo superior a 10 maços / ano). No entanto, este estudo não encontrou nenhum benefício da OHB em fumantes leve a moderados.

Diferentemente dos resultados de Otto et al., esta pesquisa demonstrou um efeito benéfico da OHB na viabilidade de retalhos dorsais cutâneos em animais expostos ao tabaco. Após analisar o desfecho primário (viabilidade do retalho), analisaram os parâmetros microscópicos desses dois grupos.


O estudo acredita que a que a OHB poderia induzir neoangiogênese e tecido de regeneração. De fato, H Ag˘ir et al. mostrou um aumento na densidade do vaso em retalhos cutâneos em animais tratados com OHB.


Provavelmente, uma terapia com pressão de oxigênio mais alta pode fornecer mais oxigênio ao tecido isquêmico e, consequentemente, melhorar a sua capacidade regenerativa.


Vários estudos analisaram o mecanismo de ação da OHB, que se baseia no oxigênio de alta pressão no sangue, aumentando a entrega do oxigênio do tecido e saturação da hemoglobina e difusão plasmática de oxigênio. Sob condições deletérias (tabagismo, diabetes e hipóxia), a lesão mitocondrial pode produzir espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS).


Essas espécies reativas ativam vias de sinalização intracelular sensíveis ao estresse, que causam lesão celular e apoptose. O aumento do oxigênio pode diminuir a produção dessas espécies reativas de oxigênio e nitrogênio.


Além disso, a OHB produz um efeito benéfico sobre mediadores inflamatórios, peroxidação lipídica, energia celular e fluxo sanguíneo microvascular. Como resultado dessas mudanças, a OHB aumenta a neoangiogênese e diminui a resposta inflamatória em feridas crônicas. Entretanto, poucos estudos analisaram o papel da OHB na doença aguda de feridas ou retalhos.


Em feridas crônicas, existem evidências de que a OHB acelera o processo crônico de cicatrização de feridas e aumentou os níveis de expressão do gene iNOS e VEGF-a. Contudo, o efeito da OHB nas citocinas envolvidas em lesão isquêmica aguda permanece incerto. Gajendrareddy et al. mostrou um benefício da OHB na cicatrização de ferida aguda em ratos submetidos ao estresse sem efeito sobre iNOS ou Expressão do gene VEGF-a.


A diminuição do nível de expressão do gene iNOS em lesões não eram claras, e talvez o tempo de seguimento tenha sido insuficiente para mostrar um aumento no iNOS e no VEGF-a.


Dada a discrepância nesses dados, outro estudo analisando os precursores do VEGF-a e iNOS poderia elucidar essa questão. Por exemplo, a análise do HIF-alfa pode ser útil na avaliação do efeito da OHB sob tratamento agudo


Condições


Entre as limitações do estudo, é importante destacar mencionar que a pele do modelo de rato não tem uma estrutura anatômica semelhante à da pele humana.

Mesmo assim, a maioria dos estudos utiliza esse modelo devido ao baixo custo e facilidade manipulação. Além disso, em estudos futuros, planejamos analisar HIF-1 (um precursor de VEGF-a), um período de tempo diferente (14 dias) e tratamento hiperbárico com oxigênio diferente períodos.


As implicações dos resultados deste estudo para pesquisas podem ser expandidas para outros modelos de retalho, como retalho musculocutâneo e retalhos tubulares.


Conclusão

Os resultados sugerem que o uso de OHB aumentou a viabilidade dos retalhos cutâneos dos ratos expostos ao tabaco e a diminuição dos níveis de RNAm de iNos; no entanto, não alterou os níveis de VEGF-a.


O grupo OHB mostrou um aumento na área viável em comparação com o grupo controle (84% versus 47%, p = 0,009, respectivamente). O grupo de OHB apresentou um aumento nas unidades de apêndice (1,69 ± 0,54 versus 1,87 ± 0,58, p  = 0,04) e densidade de angiogênese (1,29 ± 0,45 versus 1,82 ± 0,64, p  <0,001) em comparação ao grupo controle. Houve uma diferença entre os grupos controle e OHB nos níveis de iNOS (0,926 ± 1,4 versus 0,04 ± 0,1 p  = 0,002, respectivamente).

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