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Ensaio clínico prospectivo sobre o efeito da OHB na fisiopatologia do envelhecimento da pele

O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da Oxigenoterapia hiperbárica (OHB) na pele de uma população normal, não patológica, envelhecida.


Introdução


O envelhecimento pode ser caracterizado pela perda progressiva da integridade fisiológica, culminando em comprometimento da função e suscetibilidade a doenças e morte. Sendo o órgão mais volumoso do corpo, a pele não é exceção. Existem dois tipos de envelhecimento da pele, envelhecimento intrínseco e extrínseco. O envelhecimento intrínseco, também conhecido como envelhecimento cronológico, inclui os processos fisiopatológicos comuns à maioria dos órgãos do nosso corpo, enquanto o envelhecimento extrínseco ou fotoenvelhecimento, é exclusivo da pele e está relacionado aos efeitos da radiação ultravioleta (UV) (principalmente proveniente do sol) e outros agentes ambientais aos quais a pele está exposta.


O envelhecimento intrínseco está relacionado a marcas bem conhecidas do envelhecimento celular, incluindo senescência celular, encurtamento dos telômeros, instabilidade genômica, inflamação e disfunção mitocôndria. Outro fator relevante é o enfraquecimento de moléculas da matriz extracelular, como colágeno e elastina.


O envelhecimento extrínseco está relacionado aos efeitos a longo prazo da exposição à radiação ultravioleta (UV) (sol) e outros agentes ambientais. Em contraste com a epiderme mais fina na pele intrinsecamente envelhecida, a epiderme irradiada por UV engrossa, devido à falha na degradação do desmossoma de corneócitos e a um processo de diferenciação de queratinócitos da epiderma prejudicado. A pele fotoenvelhecida mostra diminuição da expressão do colágeno tipo VII nos queratinócitos, bem como um acúmulo de tecido elástico anormal profundamente na derme, um fenótipo patológico denominado elastose solar. Os sinais clínicos incluem alterações de pigmentação, telangiectasias, aumento do tamanho da córnea, rugas profundas, queratose actínica e lesões cutâneas pré-cancerosas e cancerosas.


OHB


A Oxigenoterapia Hiperbárica (OHB) utiliza 100% de oxigênio em uma pressão ambiental superior a uma atmosfera absoluta (ATA) para aumentar a quantidade de oxigênio dissolvido nos tecidos do corpo. Exposições hiperóxicas intermitentes repetidas demonstraram induzir efeitos fisiológicos que normalmente ocorrem durante a hipóxia em um ambiente hiperóxico pela exposição relativa à hipóxia, o chamado “paradoxo hiperóxico-hipóxico”. Estes incluem restauração da função mitocondrial e biogênese, simulação de proliferação de células-tronco, migração, diferenciação e angiogênese, entre outros. Ensaios clínicos recentes mostraram que a OHB pode ter como alvo as marcas do envelhecimento no nível celular, incluindo o encurtamento dos telômeros e a eliminação das células senescentes. Nenhum estudo até o momento examinou os efeitos da OHB no envelhecimento da pele.


Materiais e métodos


O estudo foi realizado entre 2016-2020 no Centro Médico Shamir (Assaf-Harofeh), Israel. Os pacientes incluídos não tinham histórico de isquemia cardíaca ou cerebrovascular no último ano anterior à inclusão. Os critérios de exclusão incluíram: tratamento prévio com OHB por qualquer motivo nos últimos três meses, qualquer história de malignidade no último ano, qualquer declínio cognitivo patológico, insuficiência renal crônica grave, diabetes mellitus não controlada), uso de imunossupressores, contraindicações para ressonância magnética, tabagismo ativo ou doenças pulmonares.

O protocolo de OHB foi composto por 60 sessões diárias, cinco sessões por semana em um período de três meses. Cada sessão incluiu respiração 100% de oxigênio por máscara em 2ATA por 90 minutos com intervalos de cinco minutos a cada 20 minutos. As taxas de compressão/descompressão foram de 1minuto. Durante os períodos de controle e OHB, mudanças de estilo de vida e dieta e ajustes de medicação não foram permitidos.


Biópsias de pele


Amostras de pele de 5X5 mm foram retiradas das regiões pós-auriculares por uma técnica de biópsia por punção de 4 mm após preparação, drapejamento e anestesia local. As biópsias foram realizadas por um cirurgião plástico treinado. A área escolhida foi assumida como protegida da exposição solar, permitindo a exclusão dos efeitos prejudiciais do fotoenvelhecimento ou envelhecimento extrínseco da pele, e focando nas alterações intrínsecas da pele. Os participantes foram submetidos a biópsias de pele no início do estudo, após o período de controle de três meses e 1-2 semanas após a última sessão de OHB.


Processamento e coloração


O processamento e a coloração foram realizados por um técnico de patologia treinado. Todas as lâminas foram fotografadas usando um microscópio Lionheart™ FX. As seções foram examinadas e avaliadas em ordem aleatória sob condições cegas com microscopia de luz ou fluorescente. Amostras com coloração específica de baixa qualidade não foram quantificadas. É importante ressaltar que as lâminas foram avaliadas de maneira cega e os parâmetros ausentes foram preenchidos como espaços em branco em vez de números.


Análise estatística


A menos que especificado de outra forma, os dados contínuos foram expressos como média ± desvio padrão (SD). A distribuição normal para todas as variáveis ​​foi testada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. One-way ANOVA foi realizada para comparar variáveis ​​entre e dentro dos três grupos na linha de base.


Os dados categóricos são expressos em números e porcentagens e comparados por testes de qui-quadrado. Análises univariadas foram realizadas por meio do teste qui-quadrado/exato de Fisher para identificar variáveis ​​significativas (P<0,05).


Para avaliar os efeitos da OHB, um modelo ANOVA de medidas repetidas foi usado para testar o principal efeito intra-sujeito. Testes post-hoc nas médias foram conduzidos para testar as diferenças de tempo usando testes t pareados com correção de Bonferroni.


Resultados


Da coorte de 70 participantes do estudo populacional de envelhecimento normal, treze pacientes deram consentimento para biópsias de pele. Todos os treze pacientes completaram três biópsias (linha de base, período de controle de três meses e pós-OHB). Apenas os homens deram consentimento e a média de idade foi de 68,07±2,5 anos.


Fibras elásticas


As fibras elásticas foram avaliadas por coloração com Orecin. Não houve mudanças significativas no comprimento das fibras elásticas após o período de controle (6,94±1,45 vs. 5,83±1,59, p=0,091). Após a OHB, houve um aumento significativo no comprimento das fibras para 14,25±4,31 (p<0,0001, tamanho do efeito=2,71,). Além disso, houve uma diminuição significativa na fragmentação das fibras após OHB (90% vs 10% de alta fragmentação, p=0,012). Não foram observadas alterações na densidade ou espessura das fibras elásticas.


Fibras de colágeno


As fibras colágenas foram avaliadas pela coloração Trichrome. Não houve alterações na densidade das fibras de colágeno após o controle (67,84±10,98 vs. 67,90±8,62, p=0,984) com um aumento significativo demonstrado após OHB (76,61±9,52, p<0,0001, tamanho do efeito=1,10). Além disso, não houve alterações na espessura da camada papilar após o período de controle (133,22±22,42 vs. 125,64±35,18, p=0,395), enquanto uma diminuição significativa foi observada após OHB (106,60±31,01, p=0,009, tamanho do efeito =0,61).


Células de senescência


As células senescentes dos tecidos foram avaliadas pelo método de coloração de lipofuscina. Não foram observadas alterações nas células senescentes após o período de controle (3,14±1,06 vs. 3,13±1,10, p=0,956). Houve uma diminuição significativa nas células senescentes do tecido (2,48±1,23, p=0,033) pós-OHB.


Segurança


Dos 13 participantes, dois efeitos colaterais foram relatados. Um paciente teve uma infecção no local da biópsia que foi tratada com um curso de antibióticos orais de três dias. Outro paciente apresentou barotrauma moderado no ouvido que foi tratado conservadoramente com resolução completa.


Discussão


O estudo atual demonstra, pela primeira vez, que 60 sessões diárias de OHB diminuíram a espessura da derme papilar, aumentaram o comprimento e a estabilidade das fibras elásticas e a densidade das fibras colágenas com um grande tamanho de efeito em uma coorte de idosos saudáveis. Além disso, a OHB teve um impacto benéfico tanto no número de vasos sanguíneos quanto nas células senescentes. Este é o primeiro estudo humano que demonstra que uma intervenção terapêutica pode reduzir o número de células senescentes no nível do tecido.


O envelhecimento da pele começa desde o nascimento e é induzido por fatores intrínsecos e extrínsecos. O estudo focou no envelhecimento intrínseco através da obtenção de biópsias de pele de uma área protegida da luz. O envelhecimento fisiológico intrínseco inclui o chamado processo de envelhecimento clássico que contém o aumento de células senescentes (fibroblastos, melanócitos) e perda/degradação da microcirculação, além de afinamento da epiderme, afinamento da derme com aumento da espessura da camada papilar, diminuição da deposição de colágeno, fibras elásticas encurtamento e degradação.


Este método acessível de biópsia de pele permitiu obter uma melhor compreensão dos efeitos da OHB no nível tecidual. Como mostrado neste estudo, a OHB teve efeitos significativos na modulação do envelhecimento, diminuindo as células senescentes, induzindo a angiogênese e aumentando o comprimento e a estabilidade das fibras elásticas e a densidade do colágeno.


Diferentes modelos têm sido propostos para explicar a base molecular do envelhecimento da pele de acordo com as características do envelhecimento, incluindo senescência celular, perda de telômeros, mutações de DNA, disfunção mitocondrial, estresse oxidativo, inflamação crônica e outros.


Na última década, estudos pré-clínicos e clínicos demonstraram que a OHB pode atingir muitas dessas características do envelhecimento. A OHB pode melhorar a função mitocondrial e o metabolismo celular, reduzir as reações inflamatórias, reduzir a apoptose, aliviar o estresse oxidativo e auxiliar na iniciação ou facilitação da angiogênese. Embora a OHB possa induzir estresse oxidativo significativo, foi demonstrado que apenas uma única exposição hiperóxica aumenta a geração de ROS de forma aguda, enquanto exposições repetidas desencadeiam uma resposta antioxidante/removedora, tornando-se protetora com níveis normalizados de ROS.


O presente estudo, focou em dois dos mecanismos da OHB: angiogênese e senescência celular reduzida. A diminuição da perfusão tecidual ou suprimento sanguíneo tem sido associado ao envelhecimento da pele. Na pesquisa, a OHB induziu angiogênese, com aumento dos vasos sanguíneos dérmicos. Os resultados se correlacionam com nossos estudos anteriores demonstrando que a OHB pode induzir angiogênese em feridas isquêmicas que não cicatrizam e no envelhecimento cerebral.


O protocolo da OHB utiliza os efeitos induzidos por exposições hiperóxicas intermitentes repetidas, o chamado paradoxo hipóxico hiperóxico . Essas exposições hiperóxicas intermitentes induzem respostas fisiológicas que ocorrem durante a hipóxia. Assim, a OHB induz a liberação dos fatores de transcrição chamados fatores induzidos por hipóxia (HIFs) e aumenta sua estabilidade e atividade. Por sua vez, HIF-1α e HIF-2α modulam a liberação do fator angiogênico do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF).


O VEGF é considerado o regulador mestre da angiogênese e induz a migração de células endoteliais progenitoras da medula óssea para o sistema circulatório, recrutamento de células endoteliais de vasos sanguíneos existentes e sua diferenciação em vasos sanguíneos recém-formados. A angiogênese induzida pela OHB pode ter um impacto significativo no fotoenvelhecimento e no envelhecimento extrínseco da pele, onde os vasos sanguíneos são mais severamente prejudicados devido a exposições tóxicas e UV. No entanto, o presente estudo não avaliou a pele exposta à luz.


Em segundo lugar, o envelhecimento intrínseco da pele está associado a senescência celular, onde o ciclo celular de fibroblastos, melanócitos e outras células é interrompido. As principais forças motrizes para a senescência incluem o encurtamento dos telômeros, bem como outros danos não teloméricos no DNA.


O acúmulo de células senescentes com o envelhecimento reflete um aumento na geração dessas células e/ou uma diminuição em sua depuração, o que por sua vez agrava o dano e contribui para o envelhecimento. No estudo atual, a OHB levou a uma diminuição/depuração significativa na senescência celular em comparação com os níveis estáveis ​​de senescência celular na linha de base e após um período de controle. No estudo anterior, os pesquisadores demonstraram que a OHB possibilita a eliminação de células senescentes do sangue periférico juntamente com o alongamento dos telômeros. Ambos suportam efeitos semelhantes nas células senescentes dos tecidos, como a pele.


A OHB tem sido utilizada há décadas como modalidade terapêutica para feridas que não cicatrizam, enxertos e retalhos de pele comprometidos, infecções graves de pele, infecções necrosantes de tecidos moles, queimaduras, síndrome de esmagamento e outras lesões isquêmicas agudas. Mais recentemente, tem sido sugerida como pré-condicionamento prévio a cirurgias estéticas. No entanto, até onde é sabido, este é o primeiro estudo avaliando seus efeitos na pele típica do envelhecimento.


Atualmente, estão sendo investigadas muitas intervenções que, genética ou farmacologicamente (medicamentos senolíticos) têm como alvo as marcas do envelhecimento da pele. Estes incluem antioxidantes, terapia com células-tronco, retinóides, hormônios, dietas, agentes anti-inflamatórios, estratégias antiprogeria, modificações dos telômeros e outros. A maioria dessas intervenções tem poucas evidências que respaldem suas alegações com efeitos limitados. Além disso, a maioria das evidências é de modelos animais e aguarda avaliações de segurança e eficácia em humanos. Notavelmente, os retinóides tópicos mostraram aumento da espessura da epiderme. O presente estudo sugere um método não farmacológico para remoção de células senescentes. Pela primeira vez em humanos, uma intervenção terapêutica demonstrou uma redução real no número de células senescentes em nível tecidual.


Limitações do estudo


O estudo atual tem várias limitações e pontos fortes a serem considerados. Primeiro, o tamanho limitado da amostra deve ser considerado. Em segundo lugar, houve a falta de um grupo placebo separado. No entanto, os pacientes realizaram uma segunda biópsia após um período de controle para comparação e a análise da biópsia foi realizada de forma cega. Terceiro, a pele não foi avaliada e pontuada clinicamente. Quarto, os efeitos da OHB no fotoenvelhecimento não foram avaliados.


Quinto, foram avaliados dois mecanismos relacionados à OHB, angiogênese e eliminação de células senescentes, porém outros mecanismos de reversão do envelhecimento cutâneo podem estar em jogo e não foram avaliados. Por fim, o protocolo do estudo incluiu 60 sessões de oxigênio a 100% em 2 ATA, incluindo três intervalos de ar durante cada sessão para aproveitar o paradoxo hipóxico hiperóxico e minimizar o risco de toxicidade do oxigênio.


O estudo sugere que tanto dentro da sessão como entre as sessões as exposições hiperóxico-hipóxica/hipóxica relativa afetam a cascata discutida. No entanto, o desenho experimental atual não pode avaliar cada componente separadamente. Além disso, a curva de dose-resposta relacionada à pressão aplicada, tempo e número de exposições de OHB e sua relação com a expressão de HIF e seus efeitos relacionados ao envelhecimento reverso ainda não são totalmente compreendidos e mais estudos são necessários para encontrar os protocolos de OHB ideais.


Em resumo, pela primeira vez em humanos, nosso estudo indica que a OHB pode modular significativamente os efeitos fisiopatológicos do envelhecimento na pele de adultos saudáveis. Os mecanismos demonstrados incluem angiogênese e depuração de células senescentes.


O artigo original em inglês esta disponível aqui.

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