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As propriedades adesivas dos neutrófilos mediadas pela integrina são reduzidas pela OHB

Nos últimos anos, vários estudos sugeriram que a capacidade da oxigenoterapia hiperbárica (OHB) em promover a cicatrização em pacientes com úlceras diabéticas e feridas crônicas é devida à redução das citocinas inflamatórias e a uma diminuição significativa no recrutamento de neutrófilos para a área lesada. As integrinas α 4 e β 2 são receptores que medeiam a adesão de neutrófilos ao endotélio e a compreensão dos efeitos da oxigenação hiperbárica sobre sua expressão e funções em neutrófilos pode ser de grande importância para o desenho de novos protocolos terapêuticos focados em agentes antiinflamatórios. Neste estudo, o α 4 e β 2A expressão e funções das integrinas foram avaliadas em neutrófilos primários humanos obtidos de pacientes com feridas crônicas que não cicatrizam e submetidos a uma OHB prolongada (150 kPa por 90 minutos).


O efeito de um antagonista da integrina α 4 β 1 peptidomimético também foi analisado nestas condições. Uma diminuição estatisticamente significativa (68%) na expressão da integrina β 2 em neutrófilos foi observada durante o tratamento com OHB e mantida um mês após o último tratamento, enquanto os níveis de integrina α 4 permaneceram inalterados.


No entanto, a função de adesão celular de ambas as integrinas neutrofílicas α 4 β 1 e β 2 foi significativamente reduzida em 70 e 67%, respectivamente), mas α4 A integrina β 1 ainda era sensível à inibição do antagonista na presença de fibronectina, sugerindo que uma terapia combinada entre OHB e antagonistas da integrina poderia ter maior eficácia anti-inflamatória.


Introdução


A terapia com oxigênio hiperbárico (OHB) surgiu nos últimos anos como uma abordagem inovadora e uma terapia adjuvante eficaz para o tratamento de diferentes patologias. A pressão de oxigênio aplicada na câmara é geralmente de 165 a 275 kiloPascal (kPa - 1,7 a 2,8 atmosferas absolutas, ATA) e o primeiro efeito da pressurização do corpo humano é o aumento da pressão parcial dos gases e a diminuição do volume do gás. espaços preenchidos de acordo com a lei de Boyle.


O oxigênio adicionalmente disponível tem a capacidade de restaurar a oxigenação em áreas onde ocorrem hipóxia ou hipoperfusão, e pode ajudar a cicatrizar o tecido danificado. Além disso, níveis aumentados de oxigênio, que levam a mudanças na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e de nitrogênio (RNS) durante a terapia de OHB são essenciais para estimular funções de reparo específicas de macrófagos, neutrófilos e fibroblastos no processo de cicatrização. Além disso, a OHB regula a resposta inflamatória (redução do inflamassoma de NLRP3, citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-1β, IL-6 e IL-18, TNF α).


A OHB foi empregada com sucesso para controlar úlceras diabéticas que não cicatrizam e feridas crônicas, minimizando significativamente o número de amputações em relação ao tratamento padrão de feridas sozinho na população diabética.


A cicatrização de feridas é um processo complexo que envolve fatores de crescimento, componentes da matriz extracelular e diversos tipos de células. Citocinas inflamatórias, como fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e interleucina-1β (IL-1β), estão frequentemente presentes em níveis elevados no local da inflamação, como em feridas crônicas. O sistema imunológico está envolvido em todas as etapas do reparo do tecido. A resposta inflamatória evolui na cascata de adesão de leucócitos, mediada principalmente por duas famílias principais de receptores de adesão, selectinas e integrinas.


Os neutrófilos desempenham um papel crucial no processo de cicatrização de feridas ao detectar seu ambiente e responder aos sinais extracelulares por adesão, migração e outras funções efetoras. Depois de encerrar seu papel no local da inflamação, os neutrófilos sofrem apoptose e são removidos pelos macrófagos; este último evento é considerado um forte sinal para a resolução da inflamação. Embora combatam a infecção, os neutrófilos também podem ter efeitos prejudiciais, induzindo danos no tecido inflamado e levando a um atraso no processo de cicatrização e inflamação crônica.


Os neutrófilos expressam integrinas em sua superfície, contribuindo significativamente para a fase de recrutamento. Entre eles, os membros da família de integrinas β 2 , incluindo α L β 2 e α M β 2 , ligam-se à molécula de adesão intercelular endotelial-1 (ICAM-1) e a integrina α 4 β 1 reconhece a molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1 ) expresso em células endoteliais. As integrinas α 4 β 1 e integrinas β 2 estão envolvidas no início e resolução do processo inflamatório mediando a adesão de monócitos, linfócitos e neutrófilos aos vasos sanguíneos.


Este estudou investigou se a OHB poderia exercer seus efeitos modulando funções das integrinas α 4 β 1 e β 2 expressas em neutrófilos obtidos de pacientes com úlceras crônicas que não cicatrizam. O objetivo é avaliar o papel da adesão mediada por integrinas, caracterizando a expressão de receptores de integrinas em neutrófilos durante o OHB e analisando o efeito de um antagonista de integrina α 4 β 1 peptidomimético nessas condições. Se as integrinas são um alvo tanto para a OHB quanto para os antagonistas sintéticos que bloqueiam sua ativação, uma terapia conjunta pode ser hipotetizada, levando a uma diminuição mais rápida e mais forte da inflamação.


Para tanto, expressão e função de α 4 β 1 e β 2 as integrinas foram analisadass pela primeira vez em neutrófilos primários humanos isolados do sangue de pacientes com úlcera crônica que não cicatriza submetidos a OHB ou terapia padrão de feridas sozinha. A expressão dessas integrinas foi monitorada em pacientes, antes do início da exposição a OHB e durante a terapia com anticorpos específicos contra a integrina α 4 ou família das integrinas β 2 . O tamanho da área da ferida do paciente foi medido e os níveis de citocinas pró-inflamatórias foram avaliados em neutrófilos e no plasma. Os ensaios de adesão celular in vitro foram realizados na presença de um antagonista da integrina peptidomimético desenvolvido anteriormente pelo grupo de pesquisadores, para investigar se o tratamento com OHB pode influenciar o recrutamento de neutrófilos e a adesão mediada pela integrina α 4 β 1 .


Materiais e métodos


Os pacientes seguiram exclusivamente a terapia prescrita pelo médico, de acordo com as indicações do sistema público de saúde italiano. Nenhum tratamento adicional foi feito para os fins do estudo, o que não alterou nenhum protocolo terapêutico nem interferiu no progresso da cicatrização. Os pacientes do grupo OHB foram submetidos a oxigenoterapia hiperbárica prescrita e à coleta de sangue seguindo os protocolos padrão aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa do "Comitato Etico della Romagna".


Trinta pacientes do Centro Hiperbárico (Ravenna, Itália) foram incluídos no estudo entre julho de 2018 e janeiro de 2019 em dois grupos diferentes: os pacientes do grupo controle (n = 15) receberam tratamento padrão para feridas sozinho (conforme prescrito por seu médico), enquanto OHB os pacientes do grupo (n = 15) receberam OHB além do tratamento convencional de feridas. Os critérios de inclusão foram: adultos com 18 anos ou mais e feridas crônicas que não demonstraram melhora (> 50% de redução da área da ferida) após um mínimo de 4 semanas de terapia padrão de feridas.


Protocolo de OHB


30 pacientes foram selecionados e alocados em 2 grupos (controle e OHB). O procedimento de protocolo consistiu em 15 exposições OHB em uma câmara hiperbárica multiplace (sessão diária, cinco por semana de segunda a sexta-feira). Os pacientes do grupo OHB respiraram oxigênio a 100% a 245 kPa por 90 minutos em ciclos de 20 minutos separados por intervalos de respiração de ar medicinal de 3 minutos.


Classificação de feridas


Neste estudo, as úlceras foram classificadas usando Falanga Wound Bed Preparation Score, que fornece vários graus com base nas descrições e características das úlceras. O estadiamento das feridas foi feito combinando a pontuação da aparência do leito da ferida com a do exsudado da ferida. A avaliação clínica das condições da ferida foi conduzida para o grupo OHB antes do tratamento com OHB (T 0), imediatamente após a décima quinta sessão de OHB (T 15) e um mês após terminar OHB (T 1M); para o grupo controle durante a primeira avaliação por um médico (T 0 ) e após quinze dias de terapia convencional de feridas (T 15 ).


Resultados


30 pacientes, 13 homens e 17 mulheres, (idade 74,5 ± 12,7 anos) apresentando uma condição crônica de ferida que não cicatriza, foram recrutados e voluntários para participar do estudo. Todos os pacientes completaram o estudo e nenhum paciente foi excluído da análise de dados.


No geral, as feridas dos pacientes incluídos no estudo foram causadas por diferentes etiologias: 23% causadas por diabetes, 23% por insuficiência venosa, 15% por isquemia crítica de membro, 24% por trauma e 15% por vasculite.


Expressão de integrina em neutrófilos derivados de pacientes submetidos a OHB


Para estudar o efeito da OHB na expressão da integrina de neutrófilos, essas células foram isoladas de amostras de sangue provenientes de pacientes com feridas crônicas que não cicatrizaram, recebendo tratamento padrão para feridas sozinho (grupo controle) ou submetidas a OHB (grupo OHB). Para os pacientes do grupo controle, as amostras de sangue foram coletadas durante a primeira avaliação da ferida (T 0 ) e após quinze dias de terapia convencional da ferida (T 15 ); para os pacientes do grupo OHB, as amostras de sangue foram obtidas antes (T 0 ) e imediatamente após o quarto (T 4 ), o oitavo (T 8 ), o décimo segundo (T 12 ) e o décimo quinto (T 15) Tratamento OHB (ao final de três semanas; cinco exposições / semana); a última amostra de sangue foi coletada um mês após o término da OHB (T 1M ).


A OHB não alterou a expressão da integrina α 4 em neutrófilos humanos primários, tanto no mRNA quanto nos níveis de proteína nem induziu qualquer variação significativa na expressão de integrina α 4 , ao longo da duração do tratamento de OHB. Nenhuma mudança significativa na integrina α 4 expressa nos neutrófilos foi observada em ambos os pacientes do grupo de controle e OHB. Mas houve a redução da expressão de β 2 (painéis c e d) em neutrófilos provenientes de pacientes recebendo tratamento padrão para feridas sozinho (grupo de controle) e pacientes submetidos a OHB por 15 sessões (grupo OHB).O decréscimo das integrinas β 2 foi mantido até um mês após o término da OHB.


Ao contrário, as integrinas β 2 foram significativamente reduzidas por OHB tanto em níveis de mRNA quanto de proteína; esta diminuição foi mantida até o final do tratamento de OHB e também um mês após a última sessão de OHB. Os neutrófilos provenientes de pacientes recebendo tratamento convencional para feridas apenas (grupo de controle) não mostraram quaisquer alterações na expressão de integrinas β 2 .

Efeitos de OHB nas propriedades adesivas mediadas por integrina de neutrófilos


A adesão de neutrófilos obtidos de pacientes pertencentes aos grupos controle e OHB foi significativamente reduzida pela adição de anticorpos específicos de integrina capazes de bloquear as funções de integrina, demonstrando que a adesão de neutrófilos à fibronectina ou fibrinogênio foi principalmente mediada por α 4 β 1 ou β 2 integrina, respectivamente. A exposição a OHB induz uma redução significativa da adesão de neutrófilos mediada por integrinas β 2 ou α 4 β 1. Curiosamente, essa redução das propriedades adesivas de neutrófilos é mantida durante todo o tratamento de OHB e até um mês após a última sessão de OHB.


A adesão mediada por integrina foi diminuída em neutrófilos obtidos de pacientes pertencentes ao grupo OHB; nenhuma alteração foi observada nos pacientes do grupo controle. A exposição a OHB reduziu significativamente a ligação do mAb anti-β 1 HUTS-21 aos neutrófilos, nomeadamente alterando α 4Conformação da integrina β 1 (painel c).


Esses dados mostraram que as propriedades adesivas da integrina α 4 β 1 expressa em neutrófilos foram prejudicadas durante a OHB, embora sua expressão não tenha sido modificada tanto em níveis de mRNA quanto de proteína. A exposição ao OHB induziu uma redução significativa da ligação do mAb HUTS-21 aos neutrófilos, ao longo da duração do tratamento e até um mês após a última sessão de OHB, o que significa que a integrina α 4 β 1 expressa na superfície do neutrófilo estava principalmente presente em uma conformação de baixa afinidade. Os neutrófilos provenientes do grupo de pacientes de controle não mostraram qualquer variação na conformação da integrina α 4 β 1. Esses dados demonstraram que a OHB reduziu significativamente as propriedades adesivas mediadas pela integrina α 4 β 1 dos neutrófilos, não reduzindo sua expressão, mas mudando sua forma em direção a uma conformação de menor atividade.


Avaliação do tamanho da úlcera e citocinas inflamatórias em neutrófilos e no plasma após OHB


Para comparar a tendência dos parâmetros estudados com o progresso da inflamação, os tamanhos das úlceras foram medidos para pacientes do grupo controle durante a primeira avaliação e após quinze dias de terapia convencional de feridas.


Para pacientes no grupo OHB, os tamanhos das úlceras foram avaliados antes de iniciar OHB, após 15 sessões a 245 kPa (FiO 2 na máscara 100%) por 90 minutos em ciclos de 20 minutos separados por intervalos de respiração médica de 3 minutos e um mês após o término OHB. O estudo optou pela pontuação de preparação do leito da ferida de Falanga como metodologia de monitoramento para acompanhar a evolução das úlceras.


Após 15 tratamentos (três semanas; cinco exposições / semana) com OHB, foi observada uma redução significativa do tamanho da úlcera e as áreas médias da ferida diminuíram cerca de 60% em comparação com a área basal da ferida. Um decréscimo de 80% em comparação com o valor da área basal em T 0 foi percebido um mês após o último tratamento de OHB e uma melhora na pontuação da ferida foi observada após 15 sessões de OHB.

Nos pacientes do grupo controle, foi verificada uma ligeira, embora não significativa, melhora nos tamanhos das úlceras e na pontuação de Falanga após 15 dias de tratamento padrão de feridas sozinho.


Progressão da cicatrização de feridas durante e após a terapia OHB em pacientes com feridas crônicas que não cicatrizam, mostrado qualitativamente.


Imagens da mesma úlcera foram adquiridas antes (T 0 ), após 15 sessões de OHB (T 15 ) e um mês após o último tratamento de OHB (T 1M ) para pacientes do grupo OHB; durante a primeira avaliação (T 0 ) e após quinze dias de terapia padrão para feridas (T 15 ) para pacientes do grupo controle. Três conjuntos representativos de imagens de feridas para cada grupo são mostrados.


Para monitorar a inflamação neutrofílica na OHB, foram avaliados os níveis de mRNA das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1β em neutrófilos. A OHB induz uma redução significativa dos níveis de mRNA de TNF-α e IL-1β logo após a quarta sessão, que é mantida até um mês a partir da última sessão de OHB. Esses resultados sugerem uma redução do estado inflamatório induzido pela OHB. Para confirmar essa hipótese, medimos os níveis circulantes dos marcadores inflamatórios TNF-α e IL-1β usando um ensaio ELISA comercial. Observamos uma redução significativa dos níveis circulantes de TNF-α e IL-1β após a décima segunda sessão de OHB em pacientes pertencentes ao grupo OHB; os níveis reduzidos de citocinas pró-inflamatórias foram mantidos até um mês após a última sessão de OHB. Nos pacientes do grupo de controle, os níveis circulantes de TNF-α e IL-1β não variaram após 15 dias de tratamento padrão para feridas, indicando um estado inflamatório sustentado.


Efeitos da OHB no TNF-α e IL-1β avaliados como níveis de mRNA em neutrófilos primários humanos e níveis de proteína circulante no plasma.


O tratamento com OHB reduziu significativamente os níveis de mRNA de TNF-α (painel a) e IL-1β em neutrófilos isolados de amostras de sangue de pacientes com feridas crônicas que não cicatrizaram submetidos a OHB ou do grupo de controle. A OHB induziu uma redução significativa nas citocinas inflamatórias circulantes TNF-α e IL-1β partir da décima segunda sessão de OHB até um mês após o último tratamento de OHB em pacientes do grupo OHB. Nenhuma mudança nos níveis de citocinas pró-inflamatórias, tanto no mRNA dos neutrófilos quanto nos níveis de proteína circulante, foi observada nos pacientes controle.


Efeitos do antagonista de integrina RG66 na adesão de neutrófilos mediada por integrina


Mais estudos são necessários para aprofundar melhor a atividade dos antagonistas da integrina, como o RG66, na adesão de neutrófilos às células endoteliais, no recrutamento de neutrófilos no local da ferida e no papel desempenhado pela OHB.


Discussão


No presente estudo, foi observado que o tratamento com OHB reduz significativamente a expressão de integrina β 2 em neutrófilos, enquanto os níveis de integrina α 4 permanecem inalterados. Além disso, a diminuição da integrina β 2 é mantida em vários pontos de tempo durante a OHB e até um mês após a última sessão de OHB.


Em ensaios de adesão celular que empregam neutrófilos obtidos de pacientes com feridas crônicas submetidas a OHB, o tratamento com OHB induz uma redução significativa das propriedades adesivas mediadas por integrinas de neutrófilos por meio do engajamento de integrinas α 4 e β 2 . OHB não afetou a expressão de integrina α 4 , mas reduz a adesão de neutrófilos mediada por α 4 provavelmente induzindo uma mudança para a conformação inativa de baixa afinidade, conforme demonstrado pelo uso de anticorpo sensível conformacional HUTS-21.


Em neutrófilos obtidos de pacientes do grupo controle, não foram percebidos qualquer alteração na expressão de integrinas α 4 e β 2 e nas propriedades adesivas mediadas por integrina após 15 dias de tratamento padrão da ferida.


Este é o primeiro estudo no qual a expressão e as funções da integrina foram avaliadas em neutrófilos primários humanos obtidos de pacientes com feridas crônicas e durante uma OHB prolongada e comparados com aqueles isolados de pacientes submetidos à terapia padrão de feridas sozinha. Em contraste com os estudos in vitro relatados anteriormente, observamos uma redução significativa da expressão da integrina β 2 de neutrófilos ; portanto, os dados não podem ser comparados, pois esses estudos foram realizados in vitro em neutrófilos obtidos de voluntários saudáveis.


Na verdade, foi constatado um decréscimo significativo dos níveis de mRNA das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1β em neutrófilos após a exposição a OHB, um efeito que se mantém até um mês após o término da OHB. Os níveis circulantes de TNF-α e IL-1β, avaliados no plasma, foram significativamente reduzidos pela OHB se comparados aos níveis de citocinas pró-inflamatórias medidos em pacientes controle. Portanto, entre outros efeitos, a OHB pode contribuir para o tratamento da inflamação, reduzindo alguns mediadores pró-inflamatórios específicos e diminuindo o recrutamento de leucócitos e seus efeitos prejudiciais na ferida crônica por meio da redução da expressão e funções das integrinas.


Em paralelo à diminuição da expressão de citocinas pró-inflamatórias, houve uma redução significativa da área da úlcera, levando em quatro pacientes a cicatrização completa. Esses dados ainda estão de acordo com o papel da OHB na aceleração da cicatrização de feridas crônicas, conforme descrito anteriormente.


A eficácia da OHB parece derivar de uma combinação complexa de eventos sistêmicos sobrepostos e alterações locais na ferida. Os efeitos sustentados da OHB observados neste estudo podem ser devidos à redução geral do estado inflamatório dos pacientes, conforme confirmado pela redução das citocinas inflamatórias circulantes e da área da ferida.


Em conclusão, o estudo demonstrou que a OHB promove a cicatrização de feridas e uma redução de citocinas inflamatórias em pacientes com feridas crônicas que não cicatrizam. A função de adesão celular de ambas as integrinas neutrofílicas α 4 β 1 e β 2 é significativamente reduzida, bem como a expressão de integrinas β 2 . Os pesquisadores propõem este estudo como um ponto de partida para avaliar melhor, no futuro, a possibilidade de usar uma terapia combinada entre OHB e antagonistas de integrina para reduzir fortemente o recrutamento de neutrófilos e levar a uma cicatrização melhor e mais rápida da ferida. O estudo completo está disponível aqui:



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